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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是目前电泳法分离活性蛋白的主要方法之一，与SDS-PAGE根据分子量大小分离蛋白质不同，它主要根据蛋白质的pI分离蛋白质。由于蛋白质的pI各不相同，所以对不同靶蛋白质需要选用具有不同pH的电泳体系。单独配制不同pH的Native-PAGE电泳胶十分繁琐，为此本公司开发了本制品。

• 即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。
  
• 非变性，电泳过程中蛋白质保持天然的构象和亚基之间的相互作用，得到的蛋白质一般都具有生物活性（而SDS-PAGE得到的蛋白没有活性）。
  
• 可以用于分析蛋白质和DNA或RNA的相互作用、蛋白修饰、蛋白构型改变、回收有活性蛋白质等试验。
  
• 电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。
  
• 本制品足够30次mini PAGE电泳。

1. 确定浓度：对分子量在100kD以上的蛋白质，可选用3～5%的胶；对分子量在20～150kD之间的蛋白质，可选用5～10%的胶；对分子量在10～80kD之间的蛋白质，可选用10～15%的胶。对未知样品，建议使用7.5%的胶。
   
2. 配制10% APS：按每0.1g过硫酸铵干粉加1mL去离子水的比例配制10%的APS溶液，该溶液可以在4℃存放一周。
   
3. 配制30% Acr-Bis(19:1)：在装有60g丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入146mL自备的去离子水和3g甲叉双丙烯酰胺，充分摇晃直到溶解（约需10～20分钟）即得200mL 30% Acr-Bis(19:1)。
   • 此溶液最好在一个月内用完，必须4℃避光保存。
4. 配10mL分离胶：在一个25mL的三角瓶中，先加入4.2mL去离子水、3.3mL 30% Acr-Bis(19:1)和2.5mL 4×低pH分离胶配胶液(pH4.5)。
   
   • 如果配制其他体积，请按比例调节各成分用量。
5. 摇晃混匀后抽真空10～15分钟以去除溶液中的氧气。
   • 氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除的话将影响丙烯酰胺聚合反应，聚合所花时间延长。
6. 加入50μL新配制的10% APS和10μL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
   • 这是配制10mL胶的用量，配制更大体积的胶则按比例增加。
   • 由于在低pH缓冲液中PAGE聚合速度降低，所以需要加倍上述两成分的用量。上述量已经加倍。
7. 在胶面距离顶部1～1.5cm的时候停止灌胶。然后覆盖一层1～5mm厚的水，使胶顶部液面平整。由于比重不同，水和丙烯酰胺溶液不会混合。
   
8. 室温聚合30～60分钟后，用1×分离胶配胶液洗涤凝固的胶的顶部，待用。

• 浓缩胶可以提高分辨率，适合于成分复杂的样品，一般使用浓度为4%。
  
• 使用浓缩胶时蛋白质泳动速度主要跟其尺寸和形状相关。
  
• 因浓缩胶pH跟分离胶pH不同，蛋白质可能会发生聚合和沉淀。
  
• 对成分单一的样品，可以不用浓缩胶，此时蛋白的泳动速度主要跟其电荷密度，尺寸和形状相关。

9. 配10mL浓缩胶：在一个25mL的三角瓶中，先加入6.2mL去离子水、1.3mL 30% Acr-Bis(19:1)和2.5mL 4×低pH浓缩胶配胶液(pH6.7)。
   • 如果配制其他体积，请按比例调节各成分用量。
10. 摇晃混匀后抽真空10～15分钟以去除溶液中的氧气。
    • 氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除的话将影响丙烯酰胺聚合反应，聚合所花时间延长。
11. 按上表用量加入50μL 10% APS和15μL TEMED，迅速摇匀后在已经凝固的分离胶上倒胶。
    • 这是配制10mL胶的用量，配制更大体积的胶则用量需按比例增加。
12. 在液面达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
    
13. 室温聚合30～60分钟，拔出梳子，用1×电泳液冲洗加样孔。
    
    • 本试剂盒提供可配10L 1×电泳液的干粉，用前需将所有干粉溶于不超过900mL水中，用约80mL冰乙酸调pH值至4.5，然后定容至1L，得10×电泳液，可以室温放置，用时再稀释成1×电泳液。稀释后一般不需要再调节pH，但保险起见，可以用pH试纸测试一下1×电泳液。低pH电泳缓冲液的pH是4.5。

14. 将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽加入足够1×电泳液。
    
15. 连接电极。如果浓缩胶和分离胶的pH高于靶蛋白pI，靶蛋白将带负电荷并向阳极移动，可以按标准的SDS-PAGE方法接通电极（上阴极下阳极）；如果浓缩胶和分离胶pH低于靶蛋白pI，靶蛋白将带正电荷并向阴级移动，此时应该下阴极上阳极。
    
16. 300 V预电泳直到电流不再降低（约需要30分钟）以去除残留过硫酸铵。
    
17. 换电泳液。
    
18. 在液体蛋白质样品中加入5×低pH上样液（16μL液体样品加4μL上样液）后上样。0.75mm厚的胶可以上10μL，1.5mm厚的胶可以上20μL。在未用加样孔中也要加1×上样液以防有样品的空道的样品扩散。
    
    • 如果用考染检测，每个孔的蛋白最好在50～100μg总蛋白，如果银染则只需要1μg即可。
      
    • 样品如果是蛋白质沉淀，可用1×上样液直接溶解蛋白质沉淀后再上样。
      
    • 蛋白质溶液或沉淀中不能含有能够改变上样液pH的残留成分（如蛋白质沉淀剂TCA），用前最好用pH试纸测试一下，不在上样液的pH范围时就用酸或碱调到正常范围。
      
    • 大量样品可用透析法调pH。
19. 上样自备的天然PAGE蛋白质标准或等电电泳的标准品（如果有的话）。
    
20. 用15 mA（对0.75mm厚的胶）或30mM（对1.5mm厚的胶）的电流电泳直到染料移动到分离胶底部。微型胶一般需要1～2小时。
    
    • 电泳过程最好在冷室或有冷却系统，以免电泳产热使蛋白质变性。
21. 终止电泳，取出凝胶进行后续的实验处理（如染色或酶活性检测）。